Pokroky v mikroskopii Vedci pootvorili dvere do sveta, ktorý bol doteraz neviditeľný

Nemeckí vedci vyvinuli spôsob, ako mikroskopom zobraziť konkrétne proteíny v celom myšom tele naraz. Ich výsledky publikoval minulý týždeň časopis Nature Biotechnology.

Hovorí sa, že je lepšie raz vidieť než stokrát počuť. Niečo podobné platí aj vo vede, keď priame zobrazenie je niekedy výpovednejšie než nepriame merania.

Ktorý biológ by nechcel vidieť dovnútra celého organizmu s rozlíšením jednotlivých buniek? A vidieť pri tom, kde sa nachádzajú konkrétne proteíny, ktoré ho zaujímajú? 

„Tkanivové čírenie“

Problémom však je, že vyššie organizmy sú nepriehľadné. To je spôsobené najmä rozptylom svetla, ktorý nastáva na rozhraní vodného prostredia bunky a bunkových membrán, ktoré obsahujú lipidy.

Zhruba posledné dve desaťročia vedci vyvíjajú rôzne metódy na odstránenie tohto rozptylu, ktoré sa súhrne dajú označiť ako metódy tkanivového čírenia (z angl. tissue clearing). To sa dá docieliť buď vyrovnaním optických vlastností lipidových membrán a vodného roztoku vo vzorke, napríklad pridaním vysokej koncentrácie sacharózy, alebo, o niečo účinnejšie, pomocou úplného odstránenia lipidov zo vzorky.

Čítajte tiež

Prelomový vedecký výskum Keď vírusy pomáhajú liečiť

Martin Lukačišin

Vedci ukázali cestu k liečeniu zápalového ochorenia čriev pomocou bakteriálnych vírusov. Prvé testy priniesli sľubné výsledky.

Prvým veľkým úspechom tkanivového čírenia bolo zobrazenie neurónových spojení v myšacom mozgu skupinou Kurta Deisserotha zo Stanfordskej univerzity v roku 2013. Jeho tímu sa vtedy podarilo zobraziť neurónové spojenia v jednomilimetrovom kúsku myšieho hipokampu tak, že molekuly vo vzorke najprv zafixovali pomocou polyakrylamidového gélu a potom z nich pod elektrickým napätím špeciálnym saponátom vymyli lipidy.

Odvtedy metódy tkanivového čírenia výrazne pokročili, no okrem zjavného faktu, že tieto metódy sa dajú uplatniť len na už neživé vzorky, ostával stále ešte jeden zásadný nedostatok.

Ako označiť konkrétne proteíny?

Už takmer storočie majú biológovia k dispozícii metódu na zobrazovanie polohy proteínov v bunkách a tkanivách. Táto metóda sa volá imunofluorescencia.

Imunofluorscencia je učebnicový príklad metódy, ktorá je inšpirovaná biologickým javom, no prepožičala si ho na celkom iný účel.

Imunitný systém je schopný generovať protilátky, teda stredne veľké proteíny, ktoré sa dokážu špecificky viazať na veľkú paletu rôznych cieľov a neutralizovať tak patogény. Pri vyvíjaní metódy imunofluorescencie si vedci takéto protilátky osvojili na celkom iný účel. Tá je založená na tom, že protilátka voči relevantnému proteínu sa laboratórne spojí s fluorescenčnou molekulou, teda takou, ktorá vo fluorescenčnom mikroskope emituje farebné svetlo. Vďaka tomu vieme pomocou imunfluorescencie presne mapovať prítomnosť relevantných proteínov vo vzorke.

Čítajte tiež

Vedecká i etická kontroverzia V laboratóriu vytvorili syntetické ľudské embryá. Čo to pre nás znamená?

Martin Lukačišin

Vedeckou obcou sa prehnala správa a vyrobení syntetických ľudských embryí. O čo ide a aké možnosti i problémy tento objav otvára?

Doterajšie metódy čírenia tkanív však neboli s imunofluorescenciou kompatibiliné. Protilátky sú totiž príliš veľké molekuly na to, aby do nedostatočne vyčíreného tkaniva vnikli.

Vedci tak boli doteraz odkázaní buď na prácne a nepraktické používanie geneticky manipulovaných myší, ktoré majú fluorescenčné označenie konkrétnych proteínov zakódované už vo svojom genóme, alebo na používanie nanoprotilátok, ktoré sú síce menšie a do tkaniva vnikajú ľahšie, no sú pre vedcov oveľa menej dostupné.

Mníchovský tím Aliho Ertürka sa teraz podujal tento problém odstrániť s hypotézou, že protilátkam vo vniknutí do vzorky bráni najmä cholesterol nedostatočne odstránený z bunkových membrán. Experimentálne otestovali niekoľko chemických derivátov oligosacharidu cyklodextrínu, ktorý sa na odstránenie cholesterolu zo vzoriek používa, a našli niekoľkonásobne účinnejší variant.

Vďaka tomu dokázali vzorky vyčíriť tak, že protilátkami bežne používanými pri imunofluorescencii bolo možné „ofarbiť“ a následne mikroskopicky zobraziť aj veľmi hrubé rezy tkanivami. A výsledok je skutočne ohurujúci, ako už na prvý pohľad vidno z publikovaných snímok.

Nervová sústava v dva centimetre hrubom reze myšou, zobrazená pomocou proteínového markeru prítomného v neurónoch. Farba označuje polohu daného bodu v priestorovej hĺbke. Prebraté z Mai et al. (2023) v licencii CC-BY-4.0.

Použitie pri sledovaní imunitnej reakcie na metastázy

Publikovaná metóda bude mať mnohostranné využitie. Samotní autori však hneď ukázali aj dve možné použitia takejto mikroskopie.

Jednou z nich bolo štúdium takzvaných terciárnych lymfatických uzlín, teda zhlukov imunitných buniek, ktoré sa v zdravom tele nevyskytujú, ale vznikajú pri určitých chorobných stavoch, napríklad pri autoimunitných ochoreniach alebo rakovine. Ich funkcia pri týchto ochoreniach nie je jasná, no špekuluje sa, že imunitné bunky z týchto zhlukov by mohli hrať dôležitú úlohu pri imunitnej liečbe rakoviny, teda takej, ktorá na boj proti rakovine priamo využíva imunitný systém pacienta.

Čítajte tiež

Imunoterapia rakoviny Aj imunitný systém niekedy spí

Martin Lukačišin

Švajčiarski vedci zistili, že čas dňa hrá dôležitú rolu pre účinnosť imunitnej liečby rakoviny.

Vedci pokusným myšiam pod kožu vpravili bunky vysokometastatickej rakoviny prsníka a po 14 dňoch touto novou mikroskopickou metódou študovali rozmiestnenie a veľkosť terciárnych lymfatických uzlín. Zatiaľ čo v primárnom nádore a pľúcnych metastázach ich našli pomerne veľký počet, v črevných metastázach bol ich počet relatívne malý.

Ako podotýkajú autori, geneticky modifikovaný model myši, ktorý by umožňoval štúdium týchto zhlukov imunitných buniek, momentálne neexistuje, čo robí ich metódu v súčasnosti jedinou možnou pre štúdium terciárnych uzlín.

Tento objav tak vedcom i nám všetkým znova o čosi viac pootvoril dvierka do sveta, ktorý bol kedysi pre ľudí neviditeľný.

Autor je výskumník v oblasti systémovej biológie.